Denaturación y renaturación

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  El ADN es una molécula de tipo polímero, es decir una molécula compuesta por miles, millones o más átomos que se organizan en módulos repetitivos en una estructura tridimensional que puede ser aproximada a modelos gracias a sus propiedades biofisicoquímicas. Pero el ADN es también una molécula encargada de almacenar información biológica, una propiedad mucho más difícil de describir, no solo en términos moleculares, sino también en términos filosóficos y ontológicos. Basados en información del grupo de Morgan, ya se sabía que el gen, fuera lo que fuere, se encontraba almacenado en segmentos de los cromosomas. Ya después de 1953 quedó establecido que la naturaleza química del gen se basaba en el ADN.

Figura 55.  La mitosis. Texto La razón por la cual la meiosis funciona es porque al principio la célula posee cuatro copias del genoma, en la primera citocinesis los cromosomas duplicados se parten a la mitad, dejando las células en anafase II con dos copias del genoma. Al final de la última citocinesis los cromosomas homólogos se separan, dejando solo una copia del genoma por célula meiótica.

Figura 56.  Efecto del calor en la estructura del ADN. Desde este punto en adelante modelamos al ADN del siguiente modo, una cinta que representa a los azucares y a los grupos fosfato, mientras que las bases nitrogenadas están representadas por escalones con sus colores estandar (YouTube).

Por lo anterior se podía decir que la suma de todos los genes correspondería a la suma de las moléculas de ADN contenidas en los cromosomas. La totalidad de genes de un organismo se denomina genoma, y se encuentra contenido en una copia simple en una célula haploide de cromosomas simples. El genoma puede presentarse en copias en diferentes células. Una célula diploide que termina su mitosis posee dos copias del genoma; pero cuando va a indicar la mitosis, es decir, cuando tiene sus cromosomas duplicados, la célula diploide posee cuatro copias del genoma.

A pesar de que inicialmente se comprendía que el genoma era algo complejo, con el paso de los años se ha llegado a comprender que la complejidad avizorada inicialmente era pobre con respecto a lo que se presenta en la naturaleza. Por ejemplo, inicialmente el genoma fue definido en torna a la suma de genes ubicados en las moléculas del ADN, esta visión se ha quedado corta al darse cuenta de que el ADN depende indisolublemente de proteínas que regulan su expresión o hasta su tasa de mutación. Sin embargo, antes de hablar de temas tan complejos, vale la pena iniciar con dos propiedades que afectarán al ADN, y son la denaturación y la renaturación.

La denaturación del ADN

Tal como fue propuesto originalmente por Watson, las dos hebras de la molécula del ADN se encuentran unidas entre sí por interaccione polares débiles, tanto por puentes de hidrogeno generadas por las bases nitrogenadas, así como por las interacciones de van de Waals que son importantes en moléculas de gran tamaño. La solución salina con ADN cambia sus propiedades físicas a medida que la molécula se denatura, por ejemplo, las medidas de absorbancia de luz ultravioleta. La temperatura para que la mitad de las hebras de ADN se hallan denaturado cambian dependiendo del contenido de bases nitrogenadas. Esto se debe a que la cantidad de puentes de hidrogeno es diferente, en la pareja A-T hay dos puentes de hidrogeno, mientras que en la CG hay tres. Si la molécula posee una mayor cantidad de parejas CG, la cantidad total de puentes de hidrógeno será mayor, y por lo tanto la molécula estará unida más fuerte y se necesitará una mayor temperatura para poder separar las dos hebras de la molécula del ADN.

La renaturación del ADN

La separación de las dos hebras de ADN mediante cambios de temperatura era un resultado esperable en base a lo que se sabe de las interacciones débiles, lo que en verdad llamó la atención de los bioquímicos fe que, al bajar la temperatura, las dos hebras se renaturen de forma determinista. La secuencia de bases nitrogenadas en cada hebra es complementaria a su contraparte, y las interacciones de todo el conjunto provocan que las dos hebras encajen perfectamente. Este resultado era prácticamente inconcebible en su tiempo.

En 1960, Julius Marmur "1926-1976" y Paul Doty "1920-2011" de la universidad de Harvard encontraron que al bajar la temperatura lentamente de una solución salina con ADN bacteriano que había sido denaturado térmicamente, este recuperaba todas las propiedades de doble hélice que había tenido antes de la denaturación. Esta propiedad de recuperar las propiedades originales ha servido de base para uno de los métodos de investigación más importantes de las ciencias biológicas modernas, y es la amplificación del ADN por medio de la reacción en cadena de la polimerasa que será descrita en artículos futuros con mayor detalle.

La renaturación es la propiedad del AND para recuperar sus propiedades originales después de haber sido denaturado, mientras que la recanalización hace referencia a la capacidad de la secuencia complementaria de detectar su contraparte y acoplarse a ella de forma específica sin la ayuda de enzimas. Esta propiedad ha permitido el desarrollo de múltiples métodos, por ejemplo, la detección de secuencias específicas mediante el uso de secuencias cortas de ADN de diferentes fuentes. Po ejemplo, sacar una secuencia de un gen de una mosca y buscar sus equivalentes en el ser humano. A esta metodología se la conoce como hibridación del ADN, y fue una de las técnicas más empleadas para el desarrollo de la taxonomía durante la segunda mitad del siglo XX.

Factores que afectan la denaturación y la renaturación

Si bien el genoma hace referencia a la totalidad del material genético, incluyendo los elementos regulatorios como las proteínas estructurales, en este contexto hace referencia solo al ADN y su longitud. Esto es porque la definición original del genoma estaba enmarcada únicamente en torno al ADN. Muchos factores determinan la tasa de renaturación de una preparación dada de ADN, por ejemplo:

1-  La fuerza iónica de la solución.

2-  Temperatura de incubación.

3-  La concentración de ADN disuelta en la solución

4-  Período de incubación

5-  El tamaño de las moléculas.

Tamaños de algunos genomas pequeños

Para determinar los efectos de diferentes variables se emplearon originalmente una serie de modelos biológicos con genomas relativamente pequeños, como el virus MS-2, el virus T4 y la bacteria Escherichia coli.

·       MS-2: Es un bacteriófago “devorador de bacterias” icosaédrico de ARN de cadena positiva que infecta a la bacteria Escherichia coli: Es muy empleado en biología molecular.

·       Virus T4. También es un bacteriófago de E. coli. Su estructura es compleja con cabeza, cuello y cola. Su ADN es bicatenario.

·       Escherichia coli: Tal vez sea el ser vivo mejor conocido por la ciencia, siendo el modelo biológico más ampliamente empleado en el laboratorio.

En cuanto al tamaño respectivo de cada genoma:

·       El virus MS-2 posee 4.0×10³ pares de bases.

·       El virus T4 posee 1.8×10⁵ pares de bases.

·       La bacteria E. coli posee 4.5×10⁶ pares de bases.

Figura 57.  Tamaño del genoma. En el eje (X) está tanto el tamaño como la velocidad de la reacción, y en el eje (Y) el porcentaje de asociación. Entre más pequeño es el genoma, la velocidad de asociación es mucho más rápida. En este caso el genoma del virus MS-02 se renatura antes que los demás.

Denaturación y renaturación del genoma viral y bacteriano

Comparando los genomas del virus MS, T4 y de la bacteria Escherichia coli la diferencia más evidente es su tamaño. Para comparar su renaturación es necesario que las moléculas que reacciones posean tamaños equivalentes, típicamente entre unos mil pares de bases. Las moléculas de ADN pueden ser fragmentados mediante una variedad de métodos, como el empleo de enzimas o forzar a la molécula a pasar por un filtro con altas presiones. Cuando se tienen estos tres tipos de genoma mezclados y cortados a 1000 pares de bases, el genoma del virus MS2 se renatura más rápido, seguido por el T4, y finalmente la de Escherichia coli.

Denaturación y renaturación del genoma eucariota

La cinética de renaturación de los genomas viral y bacteriano contrasta abruptamente con los resultados ara los genomas de eucariotas como los mamíferos, los cuales fueron obtenidos originalmente por Roy Britten y David Kohne de la Universidad de Carnegie. A diferencia de los genomas más simples, en los mamíferos se generan etapas marcadamente diferentes. Cuando la tasa de recanalización es mayor, significa que la probabilidad de que una secuencia encuentre su pareja es muchísimo mayor, mientras que cuando la velocidad es menor, la probabilidad de que una determinada secuencia encaje es menor.

Estas diferencias reflejan el hecho de que el genoma eucariota posee segmentos repetitivos y segmentos no repetitivos que operan casi al azar cuando tiene que ver con la recanalización de dos hebras de ADN. Este resultado fue la primera pista de que el ADN eucariota no era simplemente una progresión lineal de genes sin espacios intermedios, tal como si sucede en las bacterias. La complejidad del genoma eucariota es generalmente más grande.